Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является быстрым, хорошо воспроизводимым методом, который требует малого количества анализируемого вещества и используется для количественного, качественного анализа и препаративного выделения [13].
Для флавоноидов более употребительны колонки с обращенно-фазными сорбентами (RP-8; RP-18) и детектирование с помощью УФ-видимого детектора с переменной длиной волны. В настоящее время широко используется фотодиодный детектор, позволяющий одновременно с выделением пика на хроматограмме получать УФ-видимый спектр вещества, соответствующего этому пику. Такой экспериментальный прием значительно облегчает задачу идентификации веществ.
Подвижные фазы (элюентные системы), как правило, бывают бинарными и содержат подкисленный полярный компонент (водные растворы уксусной, перхлорной, фосфорной или муравьиной кислот) и менее полярный органический растворитель (метанол или ацетонитрил). Подвижная фаза может поступать в колонку как в изократическом, так и в градиентном режиме, когда в ходе процесса хроматографирования происходит во времени изменение соотношения компонентов подвижной фазы [13,14].
Градиентный режим наиболее подходит для разделения сложных смесей флавоноидов. Для колонок с обращенно-фазными сорбентами типичные градиентные программы основаны на использовании подвижных фаз с преобладанием на старте доли полярного растворителя с дальнейшим постепенным возрастанием доли менее полярного растворителя.
Соотнесение пика на хроматограмме с «принадлежащим» ему веществом является наиболее трудной задачей. Удобным приемом является использование параллельного хроматографирования хорошо известных, так называемых стандартных образцов и сравнение с ними хроматограммы исследуемого объекта. Стандартное вещество в идеале должно быть наиболее родственно флавоноидам и иметь подобные хроматографические свойства. В тех случаях, когда стандартное вещество хроматографируется в равных условиях, но параллельно, его называют внешним стандартом. Внутренний стандарт (добавляется в исследуемую пробу перед вводом в хроматограф) должен отвечать следующим условиям: в исследуемой смеси не должно содержаться аналогичное вещество и пик стандарта не должен перекрываться с каким-либо соединением в смеси. Такие ограничения отсутствуют в случае применения внешнего стандарта.
Преимуществами внутреннего стандарта является подтверждение достоверности экстракции, подготовки образца, хроматографической процедуры. В качестве стандартного вещества для флавоноидов часто используется рутин, являющийся коммерческим доступным продуктом. Он хорошо подходит для количественного анализа флавоноловых гликозидов. Для содержащихся в смеси других флавоноидов могут быть использованы такие коммерчески доступные стандарты, как апигенин-7-глюкозид – для флавоновых гликозидов, катехин – для флаван-3-олов, нарингенин – для дигидрофлавонов, дигидрокверцетин – для дигидрофлавонолов, даидзеин – для изофлавонов [13,14].
Для количественного анализа строится кривая зависимости концентрации флавоноида от площади пика для каждого стандарта в тех же самых хроматографических условиях (длина волны, растворитель), которые применяются по отношению к исследуемой смеси. Соответствующие калибровочные кривые могут быть использованы для расчета количества флавоноида, представляемого каждым пиком ВЭЖХ хроматограммы. В настоящее время практически исчезла надобность в построении калибровочных кривых в связи с обеспечением хроматографов компьютерной системой обсчета площадей пиков [13,14].
На примере хроматографирования смеси флавонов и флавонолов в обращенно-фазном варианте (рисунок 1.5) показано, что порядок выхода флавоноидов коррелирует с числом гидроксильных групп, а именно: время удерживания возрастает по мере снижения числа гидроксильных групп в молекуле.
Хроматографические условия: колонка Sep-Pak C-18, градиентный режим: метанол – 5 мМ, H3PO4.
Рисунок 1.5 – Хроматограмма смеси флавоноидов
Описание пиков и времени удерживания представлены в таблице 1.3.
Таблица 1.3 – Время удерживания различных флавоноидов
Пики |
Число ОН-групп |
Время удерживания, мин |
1 – мирицетин |
1 |
11.5 |
2 – кверцетин |
2 |
19.5 |
3 – лютеолин |
3 |
23.0 |
4 – кемпферол |
4 |
31.0 |
5 – апигенин |
5 |
33.5 |
Производство диацетон - L -сорбозы из L-сорбозы
Диацетон-L-сорбоза (ДАС) — кристаллическое вещество с Tпл=78°С, хорошо растворима в воде, бензине, эфире, бензоле и других органических растворителях. Получают ДАС в виде раствора светло-коричневого цвета с содержанием сухих веществ не менее 14—17%. Процесс ацетонирования является одной из основных ...
Действие воды на организм человека
Если правильно соблюдать питьевой режим, то надолго сохранится работоспособность и организм не будет ни обезвожен, ни перегружен жидкостью. При помощи жидкости - пота - из организма выделяются различные шлаки-токсины, всевозможные отработанные продукты метаболизма. Тело очищается через поры так же ...
Механизм образования продуктов аллилирования НБН
Этот процесс включает гидридное элиминирование после встраивания молекулы субстрата по связи Ni – аллил. В присутствии НБН образуется интермедиат А cis, exo – строения. Далее происходит замыкание четырехчленного кольца (направление a), с образованием cis, exo продукта I, имеющего метиленциклобутано ...
Алхимия - своеобразное явление культуры, особенно широко распространённое в Западной Европе в эпоху позднего средневековья. Слово «алхимия» производят от арабского алькимия, которое восходит к греческому chemeia, от cheo — лью, отливаю.