Количественное определение рутина и кверцетина в лекарственном растительном сырье методом хроматомасспектрометрии

Применимость и аналитические качества масс-спектрометрии в области количественного определения природных флавоноидов в значительной мере определяются возможностью ее комбинации с другим методом, таким как жидкостная хроматография. Соединение жидкостного хроматографа и массспектрометра осуществляется с помощью интерфейса, обеспечивающего удаление большей части жидкой фазы из пробы перед поступлением ее в массспектрометр.

В настоящее время предложено много различных типов интерфейсов, но применяются преимущественно устройства с электрораспылением и ионизацией при атмосферном давлении, которые выполняют функции удаления жидкой фазы и ионизации молекул анализируемых веществ. Анализ данных хромато-масс-спектрометрии производится двумя способами. По первому способу осуществляется анализ масс-спектров, зарегистрированных в различных точках масс-хроматограммы, путем сравнения с масс-спектрами эталонов, собранными в базе данных (библиотечный поиск), или же структурные фрагменты молекулы определяются с использованием спектро-структурных корреляций. По второму способу регистрируются и анализируются масс-хроматограммы по полному ионному току, по отдельным ионам или группам ионов. Такие ионные масс-хроматограммы позволяют обнаруживать и подтверждать структуру компонентов смеси и применимы для количественного определения флавоноидов.

Оборудование, материалы и реактивы:

- Жидкостной хроматограф Dionex UltiMate3000 для решения различных аналитических задач;

- Масс-спектрометр API 2000 производства Applied Biosystems для высокопроизводительных рутинных исследований;

- ГСО рутина;

- ГСО кверцетина;

- мерные колбы объёмом 25 см3 – 2 шт.;

- мерная колба объемом 50 мл – 2 шт.;

- виалки с пробой – 12 шт.;

- экстракт пустырника

- экстракт боярышника

- экстракт календулы

- спирт этиловый 70%

Подготовка к анализу

1) Приготовление раствора ГСО рутина: около 0.05 (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135 °С в течение 3 часов, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, растворяют в 40 мл 70 % водного спирта при нагревании на водяной бане. После растворения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят 70 % спиртом до метки [25].

2) Приготовление раствора ГСО кверцетина проводилось по методике аналогичной методике приготовления ГСО рутина (см. выше).

3) Методика приготовления экстрактов из растительного сырья

Приготовление экстрактов из цветков календулы, плодов боярышника и травы пустырника проводилось аналогично методике, описанной в п. 2.2.3.

Проведение количественного анализа биофлавоноидов в растительном сырье методом хроматомасспектрометрии

Анализ проб экстрактов проводился с использованием жидкостного хроматографа Dionex UltiMate 3000, оснащенного трехквадрупольным масс-спектрометром API 2000 c ионизацией электростатическим распылением при атмосферном давлении (API-ES). Регистрация и обработка данных проведена с использованием программного комплекса «Analyst 1.5».

Хроматографическое разделение флавоноидов осуществлялось на хроматографической колонке Luna C18 длиной 300 мм и внутренним диаметром 2 мм, в изократическом режиме при следующих условиях:

Подвижная фаза:компонент А – вода (0.37 % раствор муравьиной кислоты);

компонент В – ацетонитрил (0.33 % раствор муравьиной кислоты).

Скорость подачи подвижной фазы:0.250 мл/мин.

Объем вводимой пробы:100 мкл.

Давление на входе колонки:80 атм.

Температура термостата колонки:50◦С.

Время анализа:15 мин.

Состав подвижной фазы на выходе из хроматографической колонки регистрировался масс-спектрометрически. В ходе масс-спектрометрического анализа регистрировались хроматограммы по ионному току, обусловленные положительно-заряженными ионами 303 и 610 m/z, соответствующие молекулярным ионам кверцетина и рутина соответственно. Пример хроматограммы представлен на рисунке 2.1.